La primera construcción se atribuye a Juan Díaz y Fray Bartolomé de Olmedo, clérigos que venían con las fuerzas de Hernán Cortés. En un principio se trató de una capilla de adobe y techo de paja dedicada a Santa Catalina.

Cuando la Villa de Antequera fue declarada sede diocesana, la capilla fue reconstruida con ladrillo y teja para cumplir con esta nueva función. Por tal motivo, se ha considerado a este templo como la primera catedral de Oaxaca. Al ser terminada la nueva catedral la capilla quedó en desuso y finalmente en 1662 fue destruida por el temblor.

La nueva construcción se hizo en 1699, a la llegada de los monjes Juaninos. Posteriormente, erigieron el convento y hospital que, al concluirse en 1703, empezaron a llamar de San Juan de Dios. Con el tiempo, los terrenos que ocupaban el hospital y el convento fueron ocupados por lo que actualmente es el mercado 20 de Noviembre.

En 1864 el templo fue destruido por un incendio y tres años más tarde fue reconstruido para ser consagrado en 1890.

El templo de San Juan de Dios fue la primera iglesia de Oaxaca donde se dijo la primera misa, al pie de un árbol de huaje, porque precisamente allí pasaba entonces el río Atoyac, que más tarde fue desviado hasta las faldas de Monte Albán.

El templo es de una nave con coro. En su interior se destacan algunos óleos del siglo XVII en donde se plasman algunos episodios de la historia de Oaxaca, como la primera misa, el bautizo del rey zapoteca Cosijoeza, la La Cruz de Huatulco y la revuelta en la que fueron sacrificados los mártires de Cajonos, mismos que fueron beatificados en 2002 por el Papa Juan Pablo II. Se destaca la capilla consagrada al Señor de las Misericordias.