A mediados del siglo XVII los franciscanos erigieron la iglesia y el convento.

A lo largo del tiempo ha sido testigo de muchos eventos históricos y ha sufrido diversas restauraciones y modificaciones. Desde 1683 fue sede del Colegio de Misioneros de Propaganda Fide, uno de los colegios para evangelizadores más importantes de América. Uno de sus alumnos más destacados fue Fray Junípero Serra, importante evangelizador del norte del país.

A principios del siglo XIX con el inicio del movimiento independentista, el convento fue prisión del corregidor de Querétaro, don Miguel Domínguez y, unos años después fue tomado por Iturbide para poder dominar Querétaro desde la colina. También Maximiliano estuvo temporalmente prisionero en el Convento de la Santa Cruz, y algunos dicen que si estás en el panteón del santuario a las doce de la noche puedes encontrarte con la sombra de Maximiliano.

Es un lugar lleno de historias y leyendas dentro de la cual se destaca el Árbol de las Cruces, que se ubica en la huerta del convento y es un extraño árbol que tiene la peculiaridad de tener espinas en forma de cruz y a su vez cada cruz tiene tres espinas menores que simulan los clavos de la crucifixión. No produce ni flores ni frutos y solamente tiene hojas diminutas. La leyenda cuenta que el misionero Antonio de Margil de Jesús clavó su báculo en el jardín y que con el tiempo se convirtió en este extraño árbol.

La fachada es sobria, cuenta con un gran pórtico cuyo remate ostenta un frontón triangular.

En su interior guarde una réplica labrada en piedra de la Santa Cruz que apareció en el cielo el 25 de julio de 1531, ya que según la leyenda este hecho fue el que provocó la fundación de la ciudad. También se pueden observar los hermosos retablos de cantera rosa, algunos de estilo barroco y otros de estilo neoclásico.